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本試劑僅供研究使用???????目的：本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量。
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實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。用純化的小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α），再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量。
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試劑盒組成：
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試劑盒組成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
保存 |
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說明書 |
1份 |
1份 |
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封板膜 |
2片 |
2片 |
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密封袋 |
1個 |
1個 |
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酶標包被板 |
1×48 |
1×96 |
2-8℃保存 |
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標準品 |
0.3ml×6管 |
0.3ml×6管 |
2-8℃保存 |
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酶標試劑 |
5 ml×1瓶 |
10 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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樣品稀釋液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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顯色劑A液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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顯色劑B液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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終止液 |
3 ml×1瓶 |
6 ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
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20×濃縮洗滌液 |
15ml×1瓶 |
25ml×1瓶 |
2-8℃保存 |
注：標準品濃度依次為：640、320、 160、80、40、0?pg/mL.
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樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
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操作步驟
1. 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。
4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.?
8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
9. 測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。?測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
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注意事項：
1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。
2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。
10. ?如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
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計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD??????
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標??????準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋 ?????倍數，即為樣品的實際濃度。??????????????????
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（此圖僅供參考）
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試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2. 批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。
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檢測范圍： ?????????????????????????????????????????????
20 pg/mL – 640 pg/mL
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靈敏度： ?????????????????????????????????????????????
最低檢測濃度小于1 pg/mL
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保存條件及有效期：
1. 試劑盒保存：?2-8℃。
2．有效期： 6個月
